Neuromuskulära enheten har sedan start för 35 år sedan varit en överregional remissinstans för utredning av muskelsjukdomar. Vi som har varit engagerade i enheten har så mycket som möjligt försökt fördjupa oss i samtliga typer av muskelsjukdomar för diagnostiska ändamål och även bedrivit forskning inom ett brett spektrum av muskelsjukdomar. Tyngdpunkten för vår forskning har legat på de två stora grupperna av muskelsjukdomar – inflammatoriska och dystrofiska myopatier. Det senaste årtiondet har forskningen avseende inflammatoriska myopatier varit dominerande men vi har senare år fördjupat oss inom området regeneration, olika former av muskelfiberdöd och dystrofier.
Hela vår enhet var inbjuden för ett sammanträffande med Institutet för Myologi, Padova som avstamp för ett fortsatt fördjupat samarbete om regeneration och István Gáti och Olof Danielsson var inbjudna som föredragshållare vid symposiet. Vi var åtta personer (Olof Danielsson, István Gáti, Gunnvor Sjöö, Padideh Davoodpour, Petra Brooks, Karin Lundberg, Marita Fritz och Anna-Lena Albinsson) från Neuromuskulära enheten som deltog i 2009 Spring PaduaMuscleDays och för att träffa medarbetare från Paduas enhet för muskelforskning.
Session 1 den 26/4 under rubriken RISE2-Italy Project inleddes av Helmut Kern (Ludwig Boltzmann Institute of Electrostimulation and Physical Rehabilitation, Dept. of Physical Medicine, Wilhelminenspital, Wien, Österrike) med ett föredrag om återbildning av denerverad muskulatur med fokus på mekanismen för “excitation contraction coupling” (EC-C). Man har bl a med hjälp av elektronmikroskopi (EM) visat att EC-C-mekanismen är bevarad och delvis fungerande hos råtta med permanent denerverad muskulatur vilket stödjer hypotesen att elektrisk stimulering (ES)-inducerad cyklisk förändring av kalciumkoncentrationen kan mediera återhämtning av permanent denerverad muskulatur. Feliciano Protasi (Interuniversity Institute of Myology, Ce.S.I. Center of Research on Aging, University G. d'Annunzio, Chieti, Italien) presenterade resultat som visar att ett nytt protokoll med s k funktionell ES (FES) under flera år, särskilt om den påbörjas tidigt, medför återhämtning av muskelmassa och styrka hos patienter med långvarig ryggmärgsskada (SCI) vilket återspeglas i muskelbiopsier. Stefano Masiero (Physical and Rehabilitation Unit, Dept. of Medical Specialities, University of Padova, Italien) redogjorde för en pilotstudie om terapeutisk ES (TES) som ett möjligt komplement till annan rehabilitering vid denerverad muskulatur som följd av perifer nervskada.
Session 2 behandlade ”functional imaging” av muskelvävnad. Effekten av ES vid denerverad och degenererad muskulatur (DDM) kan monitoreras röntgenologiskt genom bestämning av muskelns täthetsdistribution. Densiteten mäts i Hounsfield units (Hu) som återspeglar vävnadens absorption av strålning. Med hjälp av datortomografi (CT) visade Thordur Helgason (Dept for Research and Development, HTS, Landspitali-University Hospital, 101 Reykjavik, Island) att – vid ES med två stora elektroder placerade på lårmuskeln – så ses den största muskeltäthetsökningen lokalt där stimuleringen är mer frekvent eller med högre intensitet. Spiral-CT kan även användas för mätning av effekten på bentäthet vilket diskuterades av Paolo Gargiulo (också verksam vid nyss nämnda inst.). Ultraljud (i form av ekodoppler eller ekomyografi – ev i kombination) kan också vara ett verktyg för att följa rehabilitering av denerverad eller immobiliserad muskulatur. Romeo Martini (Unitā Operativa di Angiologia Azienda Ospedale-Universitā di Padova, Italien) visade att – mätt med doppler – så uppvisar artärer i denerverad muskulatur ett kontinuerligt blodflöde i motsats till högresistensflödet i normal muskulatur. ES-inducerad kontraktion av denerverad muskulatur medför att blodflödet blir mer likt den normala muskelns. Ekomyografi kan användas för att bestämma muskelns tjocklek vilket visades av Roberto Stramare (Dept. of Medical-Diagnostic Science and Special Therapies, University of Padova).
Förmiddagen den 27/4 ägnades åt ett antal intressanta föredrag där Clara Franzini-Armstrong (Dept. of Cell and Dev. Biology, University of Pennsylvania, Philadelphia, USA) inledde med en överblick av musklers struktur och funktion med fokus på hur muskler adapterats till varierande funktionella krav hos olika djurslag. Myosiners utveckling och genexpression beskrevs mer i detalj av Stefano Schiaffiano (Dept. of Biomedical Sciences, University of Padova). Jonathan C. Jarvis och Lauren Fisher (Dept. of Physiology, University of Liverpool, UK) redogjorde för ett projekt där man med kvantitativ RT-PCR studerar uttrycket av gener involverade i adaptation till stimulerat muskelarbete i råtta. Vidare presenterades data ang. familjärt förekommande malign hypertermi (MH) och ”exertional/environmental heat stroke” (EHS) vilka medför risk för livshotande kris i samband med anestesi i form av halotan resp. hård fysisk aktivitet och/eller hög temperatur. I många, dock ej samtliga, fall av särskilt MH föreligger mutationer i bl a ryanodin receptor typ-1 genen (RYR1). Feliciano Protasi redogjorde för resultat på knockoutmöss där man slagit ut calsequestrin i skelettmuskel (CASQ1) – ett kalciumbindande protein i det sarkoplasmatiska retiklet (SR) som modulerar aktiviteten av RYR1. Detta resulterade i remodellering av EC-C-apparaten och funktionella rubbningar som hos hannar medförde ökad känslighet för död till följd av exponering för halotan eller värme. CASQ1 kan således vara en kandidatgen för kopplingsanalys i familjer med MH eller EHS hos vilka mutationer i RYR1 uteslutits. István Gáti presenterade resultat på odling av primära muskelceller tagna från diagnostiska biopsier där rutinhistologi inte avslöjat någon patologi. Efter en månads odling visade histologisk undersökning och EM att muskelcellerna bildat sfäroida strukturer. Destruktion av myofibrer sågs och var mest uttalad i centrum av sfäroider. Degenererade fibrer uppvisade ”ragged-red-liknande” förändringar vid färgning med Gomori-trichrom. Prolifererande celler sågs i yttre lagret av sfäroider och dessa differentierades till myofibrer vilka bildade en ringlikande struktur runt de ursprungliga degenererande fibrerna. EM visade skada på sarcolemma, störd myofibrillär struktur, förändrade mitokondrier, delande celler och växt av nya myofibrer runt ursprungliga fibrer. Sammanfattningsvis visar dessa försök att små (1-2 mm) bitar av muskelvävnad överlever in vitro och bildar sfäroider med tecken på degeneration/ regeneration och andra morfologiska förändringar som ofta ses i diagnostiska biopsier.
Session 3 ang. adaptiv respons på fysisk aktivitet på hög höjd inleddes av Paolo Cerretelli (Instituto di Bioimmagini e Fisiologia Moleculare del C.N.R, Segregate, Milano, Italien) som bl a pekade på att upptäckten av multigen-transkriptionsproteinet Hypoxia Inducible Factor (HIF-1) öppnar möjligheter till nya tolkningar av förbisedda resultat från tidigare studier såsom t ex ökningen av metabol effektivitet av rörelse vid kronisk hypoxi, bakgrunden till den s k laktatparadoxen samt betydelsen av minskad mitokondriemassa vid vistelse på hög höjd. Resultat från studier på personer som deltagit i Himalayaexpeditionen Manaslu 2008 presenterades av bl a Luana Toniolo och medarbetare (Dept. of Human Anatomy and Physiology, University of Padova). I muskelbiopsier tagna från fem män före och efter 30 dagars vistelse på 5000 meters höjd sågs en ökning av andelen långsamma fibrer men ingen signifikant ändring av tvärsnittsarea eller atrofi. Höghöjdsvistelse kan även medföra ett accelererat gasutbyte och muskulärt syreupptag vilket visades av Valeria Marconi (Verona, Italien). Neocytolys (dvs undergång av unga erytrocyter) tillsammans med nedgång av erytropoietin är ett känt fenomen efter återkomst från vistelse på hög höjd. Guglielmo Antonutto (M.A.T.I Centre of Excellence, University of Udine, Italien) påvisade med hjälp av immunofluorescence och flödescytometri en mycket kraftig nedgång i antalet unga och medelålders erytrocyter tillsammans med en dramatisk ökning av gamla erytrocyter efter vistelse på 4500 meters höjd under 53 dagar. De unga och medelålders erytrocyterna visade tecken på senescence vilket talar för att de undergår fagocytos. Cellulära mekanismer bakom muskelregeneration efter fysisk aktivitet vid hypoxi har studerats av Tiziana Pietrangelo och medarbetare (Instituto Interuniversitario di Miologia, Dipartimento di Scienze Mediche di Base ed Applicante, Universitā ´´G. d’Annuzio, Chieti-Pescara). Efter skada eller överanvändning har skelettmuskel en förmåga att regenerera tack vare aktivering av i muskel förekommande odifferentierade, vilande satellitceller vilka har stamcellsegenskaper. Dessa prolifererar som myogena prekursorceller och bildar myoblaster vilka migrerar till den skadade regionen av muskelfibern där de differentieras och fuserar med bildning av myotuber – en process som liknar myogenes. I muskelbiopsier från 6 män i Himalayaexpeditionen kunde man dock med endast ett undantag inte påvisa någon ökad regenerativ aktivitet efter 30 dagars vistelse på 5000 meters höjd. Möjliga förklaringar till denna observation diskuterades. Stefania Fulle (vid nyss nämnda inst.) beskrev en studie om genomisk analys på RNA i muskelbiopsier tagna före och efter Himalayaexpeditionen för att karaktärisera effekten av fysisk aktivitet under hypoxiska förhållanden. Man utnyttjar microarrays med 21329 oligonukleotider och fokuserar på gener av betydelse för skelettmuskel vilka delas in i sådana som spelar roll i energimetabolism eller i plasticitet. Stefania Angelucci och medarbetare (Dept. of Biomedical Sciences and Excellent Center on Aging Studies, Biochemistry & Proteomics Laboratory, Universitā G. d'Annunzio, Chieti) studerar biopsimaterial från Himalayaexpeditionen med proteomik. Efter 2D-gelelektrofores analyseras “common spots” med MALDI-TOF masspektrometri varvid man identifierat ett flertal “house-keeping” proteiner vilka kategoriseras i cytoskelett och motilitet, mitokondriefunktion, energimetabolism, cellulär stress, transport mm. Den största iakttagna förändringen representeras av mitokondriella proteiner involverade i aerob och anaerob metabolism. En signifikant nedreglering av glykolytiska enzymer sågs också. Vistelse i hypoxisk miljö på hög höjd påverkar endokrina och metabola funktioner. Andrea Benso (Div. of Endocrinology, Diabetes and Metabolism, Dept. of Internal Medicine, University of Turin, Italien) redogjorde för hormonella effekter hos deltagare i en expedition till Mount Everest med klättring och vistelse på 5200 meters höjd under 7 veckor. Man såg ökning av GH, IGF-1, IGFBP-3 samt progesteron medan testosteron sjönk. Trots viktnedgång iakttogs ingen påverkan på ghrelin. Däremot sågs sänkta plasmaglukosvärden utan ändring av insulinnivåer vilket talar för ökad insulinkänslighet. Vad beträffar tyreoideahormoner iakttogs förhöjt fritt T4, sänkt fritt T3 och oförändrat TSH.
Session 4 den 28/4 berörde myopatier. Fabio Francini (Dept. of Physiological Sciences, University of Florence, Italien) beskrev elektrofysiologisk evaluering av en rad parametrar som återspeglar graden av atrofi i denerverade skelettmuskelfibrer. Roberta Sacchetto (Dept. of Veterinary Sciences, University of Padova) och medarbetare har karaktäriserat en mutation i sarcoplasmatic reticulum Ca2+ ATPase (SERCA) som ger upphov till kongenital pseudomyotoni hos bovina boskap. Tillståndet har likheter med Brodys sjukdom hos människa (där SERCA också är muterat) och kan möjligen användas som djurmodell för denna sjukdom. Dysferlin är involverat i reparation av sarcolemma. Dysferlinopati medför en disto-proximal myopati alt. myalgi/hyperCKemi. Förloppet är dock mycket varierande även inom samma familj vilket talar för influens av epigenetiska faktorer eller miljöfaktorer. Carlo Borsatto (Dipartimento di Neuroscienze, Padova) har i en retrospektiv studie funnit att idrottande patienter hade en snabbare klinisk sjukdomsprogression jämfört med icke idrottande patienter. Fysisk aktivitet innebär mekanisk stress som kan medföra förvärrad muskelskada och bör därför begränsas vid detta tillstånd. Liksom vid en rad andra sjukdomar utgör cellterapi en attraktiv metod för att i framtiden kunna behandla muskeldystrofier. Silvia Carnio (Dept. of Biology, University of Padova) och medarbetare visade bl a att användning av kollagenbaserat biomaterial för överföring av in vitro-expanderade muskelprekursorceller till muskel i mdx-möss är effektivare än överföring av celler utan biomaterial. Man har också erhållit mer lovande resultat med en ny hyaluronsyrebaserad Hydrogel vilken är injicerbar och kan polymeriseras in situ genom UVA-bestrålning samt är permeabel. Preliminära data talar för att användning av Hydrogel för överföring av isolerade, icke förodlade satellitceller tycks kunna bidra till muskelregeneration. Carlo Alberto Rossi (Stem Cell Processing Lab, Dept.of Pediatrics, University of Padova) presenterade en studie där man efter digerering med kollagenas isolerat satellitceller från muskelfibrer hos C57BL-GFP-möss. Efter expansion av satellitcellerna har man resuspenderat dessa i Hydrogel och injicerat i skadade muskler hos C57BL/6J-möss. Efter 6 veckor sågs ökad muskelmassa och GFP-positiva fibrer och satellitceller. Man planerar att pröva protokollet i en musmodell för Duchennes muskeldystrofi. Malign hypertermi (MH) är nära besläktat med central core disease (CCD) och bägge dessa muskelsjukdomar har förknippats med mutation i RYR1-genen. Simona Boncompagni (Interuniversity Institute of Myology, Ce.S.I. Dept. of Basic and Applied Medical Sciences, University G. d'Annunzio, Chieti) presenterade data på knock-in-möss med RYR1Y522S/WT mutation vilken medför MH-liknande episoder till följd av exponering för halotan. Vid två månaders ålder kunde man se tecken på mitokondriell svullnad och partiell skada begränsade till vissa områden. Man tror att den mitokondriella skadan lokalt leder till skada på närliggande SR, T-tubuli och kontraktila element. Vid ett års ålder ses frekventa myofibrillkontrakturer som helt saknar mitokondrier och SR samt även regioner som saknar kontraktila element. Man föreslår att den initiala utlösande händelsen är en lokal obalans i kalcium-frisättning till följd av läckage av RYR1 och att mitokondrier är den organell som först tar skada av den ändrade kalciumhomeostasen. Mitokondrieskadan medför i sin tur skada på närliggande organeller såsom SR.
Det är välkänt att många sjukdomar såsom cancer, AIDS, diabetes, njur- och hjärtsvikt kan medföra kakexi. Vid cancer kan kakektiska faktorer från själva tumören inducera muskelförtvining men även cytokiner främst i form av TNF-alfa, IL-1beta och IL-6 kan bidra. Ett flertal signaltransduktionsvägar aktiveras i skelettmuskel till följd av exponering för cytokiner – främst TNFalfa som bl a inducerar atrofi. Ubiquitinering av proteiner är en betydelsefull väg för degradation men även signaltransduktion och gentranskription är involverade. Den myogena transkriptionsfaktorn MyoD har visat sig vara nedreglerad i experimentella modeller av kakexi. Induktion av MyoD är ett kännetecken på aktivering av muskelprekursorceller efter muskelskada och inhibition av MyoD motverkar muskelregeneration och inducerar apoptos i muskelceller. Sandra Zampieri (Laboratory of Translational Myology of the Interdepartmental Research Center of Myology, c/o Dept. of Biomedical Science, University of Padova) och medarbetare försöker hitta biomarkörer i muskel och serum som kan prediktera utvecklingen av kakektiskt syndrom hos patienter med kolorektalcancer. Förhoppningen är också att kartlägga de molekylära mekanismerna för kakexi och finna potentiella mål för terapeutisk intervention. Muskelstyrkan avtar måttligt från ungdomen till 45 års ålder varefter den minskar mer påtagligt för att vid 65 års ålder uppgå till 25%. Minskad muskelstyrka är en viktig orsak till funktionsnedsättning hos äldre. Silvia Corbianco (Dipartimento Neuroscienza-U.O. Neuroriabilitazione Universitaria – Universitā di Pisa, Italien) presenterade ett träningsprotokoll som kan öka muskelstyrka och motorisk kontroll samt minska fall hos äldre människor. Neuronala celler inkl. motorneuron uttrycker steroidreceptorer och studier har visat att könssteroider utövar trofisk effekt på hjärna och ryggmärg. Vittorio Bianchi (Laboratory of Physiology of Exercise and Human Performance, SH Institute, Republic of San Marino) presenterade en fallrapport där en patient med demyeliniserande sjukdom erhållit den anabola steroiden oxandrolon (20 mg/dag) tillsammans med muskelträning under tre månader. Detta resulterade i ökad muskelmassa och muskelstyrka samt motorisk kontroll. I muskelbiopsier kunde man iaktta en gruppering av muskelfibrer som talar för reinnervation. Oxandrolon kan möjligen genom ökad proteinsyntes i det perifera nervsystemet leda till remyelinisering och därmed bidra neurogeneration. Martina Piccolo (Stem Cell Processing Lab, Pediatric Dept., University of Padova) och medarbetare har studerat förmågan hos mesenkymala stamceller (MSC) isolerade från benmärg att utvecklas till muskelceller efter transplantation till mdx-möss. Efter sortering med FACS av GFP+CD44+ från BM fann man att celler som var CD44+ low hade ökad myogen potential och förmåga att bilda Pax7+ celler(muskeldestinerade) efter injektion i mdx-möss.
Olof Danielsson från NME i Linköping presenterade resultaten av undersökningar av markörer för myogenes, vars uttryck relaterades till patologiska fynd i diagnostiska muskelbiopsier från de vanligaste grupperna av neuromuskulära sjukdomar. Förutom rutinhistologiska färgningar visades uttrycket av N-CAM, PAX 7, MyoD1, Myogenin, neonatal myosin heavy chain (nMyHC), developmental myosin heavy chain (dMyHC), utrophin, MHC-I och FAS med immuno-histokemisk metod. Man fann ett högt uttryck av vilande satellitceller (PAX 7 och N-CAM positiva) i vävnad från normal och neuropatisk muskulatur samt muskulatur från dermatomoysitpatienter och att de tidiga markörerna för myogenes (Myo D1 och Myogenin) och nMyHC uttrycktes i större utsträckning i neuropatisk muskel och dermatomyosit än i normal och dystrofisk muskulatur, medan MHC-I, utrophin och FAS uttrycktes mer i dystrofisk muskel och vid dermatomyosit. Resultatet visades med seriesnitt så att samma fibrer kunde ses med olika färgningar.
Sammanfattningsvis kan man säga att konferensen gav oss möjlighet att ta del av det senaste inom en mängd olika områden inom det neuromuskulära fältet. Konferensen var välbesökt med drygt 50 deltagare. Eftersom många forskare inom det neuromuskulära området deltog, så hade vi goda möjligheter att utbyta erfarenheter och idéer om vår om andras forskning, samt att diskutera framtida samarbete. Man uttryckte ett stort intresse för den typ av vävnadsodling som vi tagit fram som modell för reparation av muskelskada och vi är nu engagerade i det större EU projekt med deltagare från flera av de enheter som deltog vid konferensen.
Hjärtliga hälsningar
Olof Danielsson István Gáti
Padideh Davoodpour
Neuromuskulära enheten, Linköping